大鼠shen小球内皮细胞分离培养
2.原代细胞培养:(1)shen脏原位灌洗:SD大鼠用25%乌拉坦腹整zhu射麻zui后仰卧固定。一般流程：transwell小室准备-细胞接种-细胞培养-transwell小室染色-显微镜拍照结果示例：图A细胞划痕实验图。胸腹部消森并分离胸主动脉,以无菌的冷Hank液漱朱洗血.同时剪破shen静脉利于液体流出。1-2min后shen脏色泽变白,取出双shen冰浴保存。
(2)shen小球分离:参照Green等方法改进。将灌洗后的shen脏撕下shen被膜.去除髓质后将皮质剪成约1-2mm'的碎块，轻碾shen皮质依次通过80.120和200目钢筛。收集shen小球。
(3)shen小球消化和培养；将提取的shen小球加人0.1% IN 型胶原酶消化后收集沉淀。LeageneMDC染色液适用于培养细胞的自噬染色，可与EB合用双染。以2x10* 的shen小球数接种于铺有1%明胶培养瓶内,加A配制好的内皮细胞培养液(MFM.Hepes 20 mmnoVL 20%胎牛xue清0. 66 U胰岛素/ml.血管内皮生长因子20 ng /ml、肝素钠100 u/ml.青莓su100 U/ml、链霉su100 μ/ml) .静止培养3 d后逐日观察shen小球的贴壁情况。待shen小球充分贴壁后常规换液.第3同进行纯化。
细胞培养中常见的生物污染包括细菌污染、霉菌污染、支原体污染、黑点污染、真菌污染和原生动物污染。这些污染在细胞培养中的特点及相应的解决办法如下：
1.细菌污染
细菌在普通倒置显微镜下呈黑色和细砂状。根据gan染菌的种类不同，可能会呈现不同的形状，培养液一般会变得浑浊、黄色，对细胞生长有明显影响。
解决方法：仔细检查器具的灭菌情况，确保通风时间和高压灭菌器的压力是否足够。7、将6孔板放入培养箱中继续培养6小时后吸出培养基换上新配置的培养基DMEM6ml+胎清600u1+三抗300u1。重要的是，与培养基接触的移液管等物品如果被污染两次，则可能会导致储存溶液也受到污染。所以一定要注意！下次使用前要检查培养基的浑浊度。此外，建议在培养基中添加抗生su。
Q:中可能出现的沉淀物是什么？
A:基于多年的实验研究，用于细胞培养的胎牛以及其它中可能会存在以下种类的沉淀物：
（1）纤维蛋白，它是经常出现的较大的沉淀物，可以达到 1-2mm，可以用肉眼观察到。(5)2000rpm离心15-25min，离心后溶液分4层，吸取中间骨sui基质细胞层(白色浑浊状)，PBS洗三次。因为都是在低温下进行收集和快速处理的，一些纤维蛋白原（可溶性的形成絮状纤维蛋白的前体）在处理过程中仍然处于溶解状态，当经过的过滤分装后，就会在瓶中凝结出现纤维蛋白沉淀。
（2）磷酸钙，它也是常见的一种沉淀物，通常会使出现浑浊，并且在 37℃ 培养的时候会增加。这种沉淀物在倒置显微镜下观察像小黑点， 这些小黑点由于布朗运动看上去可以活动，因此经常被误认为是微生物污染。
（3）胆固醇、脂肪酸酯以及一些蛋白质。他们也是中出现沉淀物的常见原因。
细胞冻存有哪些注意事项？
细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。ES细胞具有的这种能力在体外增殖并保持未分化状态及其多向分化潜能的生物学特性,使其广泛应用于生物学研究的各个领域,它的潜在医学应用价值已成为世界范围内研究的热点。因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久;细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是的。
细胞冻存的步骤：
配制含 10%DMSO 或甘油、10~20% 小牛的冻存培养液;
取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用 PBS 清洗。
去除 PBS，加入适量胰蛋白酶 (覆盖培养皿表面) 把单层生长的细胞消化下来;
离心 1000rpm，5min;
去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的终密度为 5×106/ml~1×107/ml;
将细胞分装入冻存管中，每管 1~1.5 ml;
在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者;
冻存:标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/ min;当温度达-25℃以下时，可增至-5℃~-10℃/min;到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。计算出应稀释的倍数，按MTT试剂盒要求在96孔板内接种相应浓度的细胞悬液。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱 2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。
